Медицина

РЕАЛИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ

Одним из перспективных путей внедрения в лечебную практику достижений фундаментальных исследований в области молекулярной и клеточной биологии ныне считается трансплантация стволовых клеток взрослого организма для замещения поврежденных и изношенных клеток и на этой основе запуск процессов восстановления в жизненно важных органах и тканях. Новое направление получило название "регенеративная медицина".

ПРИОРИТЕТ ОТКРЫТИЯ

Быстрое развитие регенеративной медицины во многом обусловлено тем, что страны с развитым научным потенциалом, прежде всего США и Великобритания, по завершении в 2001 г. международной программы "Геном человека" включились в реализацию нового проекта - "Стволовая клетка". В нашей стране поиск в этой области ведется в рамках утвержденной в мае 2002 г. отраслевой программы "Новые клеточные технологии - медицине". Хотя, к сожалению, она не подкреплена реальным финансированием, отечественные специалисты за прошедшие годы не стояли на месте - исследования стволовых клеток продолжались.

В международном научном сообществе сложились определенные представления о механизмах реализации их лечебного эффекта. Стало понятно: применение в клинике так называемых эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) - дело отдаленное, требующее детального изучения того, как они дифференцируются, т.е. способов превращения в определенные клеточные линии. Настораживает и то, что при их трансплантации в организм высок риск инициации роста опухолей. Поэтому до решения перечисленных проблем перспективным считают применение стволовых клеток взрослого организма. Они происходят из ЭСК, но в период развития эмбриона прошли необходимое "инструктирование", и в конечном счете являются исходными элементами поддержания деятельности систем клеточного обновления и главными инициаторами регенерации тканей и органов, чье восстановление во взрослом организме практически прекратилось. Особое место занимают в этом ряду мезенхимальные (стромальные) стволовые клетки (МСК) - они обладают рядом уникальных свойств, отличающих их от других аналогов, присутствующих в организме взрослого человека.

МСК были открыты почти 40 лет назад в лаборатории члена-корреспондента РАМН Александра Фриденштейна (Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи). Он и его ученики нашли их в популяции клеток костного мозга лабораторных животных и выделили по способности формировать на поверхности культурального сосуда колонии фибробластов (клеточной формы соединительной ткани). Поскольку открытие было сделано в то время, когда интенсивно начали изучать гемопоэтические (кроветворные) стволовые клетки - их также тестировали по способности формировать колонии в клеточной культуре in vitro и в некоторых кроветворных органах in vivo, то по аналогии ранее неизвестные клетки-предшественники назвали КОЕ-Ф (колониеобразующие единицы фибробластов).

Сам Фриденштейн первоначально считал их формирующими "гемопоэтическое микроокружение", а также обеспечивающими кроветворные клетки необходимыми цитокинами (сигнальными белковыми молекулами) и ростовыми факторами. Позднее в его лаборатории установили: в условиях in vitro и in vivo КОЕ-Ф способны к остеогенной (костной) и хондрогенной (хрящевой) дифференцировке, т.е. была продемонстрирована их полипотентность - многообразие будущих форм. В дальнейшем, когда культурами КОЕ-Ф занялись во многих странах и они получили название мезенхимальных стволовых клеток, обнаружилась их высокая пластичность - способность дифференцироваться в клетки разных типов тканей взрослого организма, включая жировую, мышечную (в том числе кардиомиоциты - клетки сердечной мышцы), нервную, сосудистого эндотелия и т.д.

Затем выяснили, что МСК содержатся не только в костном мозге, но и в пуповинной крови, жировой ткани, а по последним представлениям, пока не принятым окончательно большинством исследователей, они присутствуют практически во всех тканях в составе популяций перицитов (клеток, расположенных вдоль стенок капилляров). Фриденштейн полагал: в отличие от гемопоэтических стволовых клеток КОЕ-Ф не способны к циркуляции в крови. Значит, при повреждениях тканей (например, после локального облучения) регенерация стромального компонента обеспечивается только размножением сохранившихся жизнеспособных "местных элементов", а не клеток-предшественников, принесенных кровотоком из других, менее поврежденных участков тела. И ныне показано: в крови человека и животных имеется небольшое количество циркулирующих МСК. При различных повреждениях тканей, в том числе и головного мозга, накопление увеличивается; они способны преодолевать барьеры на пути в специализированные ткани.

Перспективы успешного клинического использования МСК поначалу обусловливали двумя соображениями. Во-первых, культуры аутологичных (собственных) стволовых клеток можно достаточно просто вырастить из небольшой порции клеток костного мозга самого больного, взятых в процессе диагностической пункции грудины или гребня подвздошной кости (порядка 1 мл костного мозга, где среди примерно 107 клеток содержится около 103 МСК). Во-вторых, предполагалось, что трансплантация МСК способна запустить процессы регенерации в двух жизненно важных органах человека - сердце и головном мозге. Следовательно, получение культур этих клеток из костного мозга пациента снимает проблему иммунологической совместимости донора и реципиента, остро стоящую при пересадках гемопоэтических стволовых клеток.

КАК ПОМОЧЬ БОЛЬНОМУ СЕРДЦУ?

В ходе многочисленных предклинических исследований, проводимых в конце XX - начале XXI в., было установлено: при воздействии на культивируемые МСК противоопухолевым препаратом 5-азацитидином или некоторыми другими соединениями (а в редких случаях и спонтанно) в культуре появляются клетки, начинающие дифференцировку в направлении кардиомиоцитов. Поэтому в ряде работ по лечению поражений сердечной мышцы использовали не культуры МСК, а клетки, уже начавшие такую дифференцировку, - в соответствии с принятой терминологией их следует называть кардиомиобластами (зародышевые предшественники кардиомиоцитов). Сотрудники нашего Центра выявили: по ряду показателей последние отличаются от исходных МСК, в том числе по такому интегральному показателю, как чувствительность к действию ионизирующих излучений. В этом случае реализуется ранее обнаруженная для гемопоэтических стволовых клеток закономерность - повышение их радиорезистентности в процессе дифференцировки в клетки-предшественники определенных кроветворных ростков (отметим: применяемый в нашем Центре метод получения культур аутологичных МСК и кардиомиобластов лицензирован Росздравнадзором Министерства здравоохранения и социального развития РФ).

Первым в России кардиомиобласты из аутологичных МСК при проведении операции аортокоронарного шунтирования и иссечения аневризмы у пациента с тяжелой сердечной недостаточностью применил академик РАМН Ренат Акчурин (Российский кардиологический научно-производственный комплекс, Москва) в 2003 г. Всего инъекциями в сердечную мышцу было введено 200 млн. стволовых клеток. Эта и последующие операции показали безопасность и эффективность такого способа их "адресной доставки". Впрочем, многие врачи используют сегодня и другую методику - так называемую "системную" трансплантацию, когда большое количество МСК (порядка 2 - 3 млн. на 1 кг массы тела) вводят внутривенно с помощью стандартной капельницы. Обоснованием такого приема являются данные о наличии достаточно специфического поступления ("хоминга") МСК, введенных в кровеносное русло, в очаги тканевого повреждения. Было показано: повышение локальной концентрации провоспалительных цитокинов (биологически активных веществ, оказывающих иммунное и/или воспалительное действие) в поврежденной ткани усиливает специфическую адгезию МСК в ее капиллярах с последующим переходом стволовых клеток в дефектные участки.

В нашем Центре разработаны методы радиоактивного маркирования МСК и получаемых из них кардиомиобластов с помощью изотопов технеция-99m и рения-188. В результате количественно изучена динамика "хоминга" системно трансплантированных мышиных стволовых клеток интактным животным, у которых сердечная мышца была повреждена противоопухолевым антибиотиком - адриамицином. Доказано: хотя через сутки после введения этих радиоактивно меченых препаратов в ней сохраняется менее 1% общего их количества, тем не менее в поврежденном таким образом сердце их содержание примерно на 50% выше, чем в том же органе интактных животных.

Кстати, низкая способность стволовых клеток задерживаться в сердце обусловливает применение относительно высоких их доз при системной трансплантации. В экспериментах на лабораторных мышах и крысах лечебный эффект локально или системно вводимых МСК в условиях искусственно вызванного инфаркта миокарда или кардиомиодистрофии наблюдается при сходных с человеком дозах вводимых клеток (несколько миллионов на 1 кг массы тела). Еще одно замечание касается того, что локальное непосредственное введение МСК в сердечную мышцу вовсе не означает, что они все там останутся и примут участие в инициации репаративных процессов. В опытах с мечеными клетками обнаружено: при инъекции их в зону, окружающую вызванный перевязкой сосуда инфаркт миокарда у мышей, через несколько часов примерно 50% меченых клеток уже находятся на "клеточных кладбищах" - в тканях печени и селезенки. Видимо, введенные относительно нефизиологическим способом в ткани даже сингенные (генетически сходные с клетками реципиента) стволовые клетки подвергаются атаке естественных киллеров и погибают. Значит, системная трансплантация МСК - наиболее физиологически правильный способ введения в организм, ибо повышенное поступление их в поврежденные ткани зарегистрировано и на других моделях, в первую очередь при локальном облучении лабораторных животных.

Судя по литературе, проводимые в различных странах мира клинические исследования эффективности системной трансплантации МСК при лечении ишемической болезни сердца, а также последствий ранее перенесенных инфарктов дали предварительные положительные результаты и требуют продолжения работ. В качестве примера приведем данные, накопленные в течение последних трех лет в нашем Центре.

Под наблюдением находилось 28 пациентов с выраженными формами ишемической болезни сердца, большинство из них в свое время перенесли инфаркт миокарда. В течение 1 - 2 лет после курса медикаментозной терапии, включавшего системную трансплантацию 150 - 200 млн. кардиомиобластов, полученных из аутологичных костномозговых МСК, у всех больных наблюдалось значительное снижение частоты приступов стенокардии, повышение толерантности к физическим нагрузкам, снижение выраженности показателей сердечной недостаточности при ЭКГ, иные положительные изменения.

Мы имеем пока лишь единичные сведения о выраженном лечебном эффекте трансплантации кардиомиобластов у пациентов с тяжелой патологией - дилятационной кардиомиопатией. Современная медицина для их лечения в качестве последнего средства использует дорогостоящую и трудно реализуемую операцию пересадки сердца. В этой связи актуально расширение соответствующих исследований по использованию трансплантации МСК или их потомства, начавшего дифференцировку.

У большинства пожилых пациентов наряду с ишемической болезнью сердца регистрировали и диабет 11 типа. Мы выяснили: после трансплантации полученных из МСК кардиомиобластов наряду с улучшением функции сердца у них значительно снижается содержание сахара в крови, достигая нормальных значений для указанной возрастной группы. Эти данные послужили основой для изучения лечебного эффекта системных трансплантаций аутологичных МСК при диабете. Уже есть свидетельства выраженного оздоровительного эффекта клеточной терапии. Предполагаем, что важный вклад в его реализацию вносит ослабление аутоиммунной реакции организма в отношении инсулин-продуцирующих клеток и запуск регенеративных процессов в тканях поджелудочной железы. В экспериментах на лабораторных животных, проведенных в ряде зарубежных центров, подобные механизмы выявлены, хотя не исключен и другой вариант - передифференцировка некоторых субпопуляций МСК в клетки-предшественники инсулин-продуцирующих клеток. Дальнейшие работы помогут установить истину.

Другая актуальная задача в этой области - поиск агентов для лекарственного сопровождения трансплантаций МСК. Несомненно, для повышения эффективности клеточной терапии необходимо активировать "микроокружение" трансплантированных и резидентных стволовых клеток. Зарубежные специалисты ныне обсуждают использование в этих целях специально создаваемых "коктейлей" из ряда цитокинов и ростовых факторов. Нам кажется, что более перспективен поиск среди ранее применявшихся агентов, обладающих повышенной активностью в процессе заживления ран.

Совместно с Институтом органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН (Москва) мы начали изучать препарат метапрогерол, синтезированный его сотрудниками в 70-х годах XX в. и успешно прошедший клинические испытания в качестве средства для лечения инфаркта миокарда в остром периоде (к сожалению, выпуск этого лекарства не начали из-за событий, связанных с распадом СССР). В экспериментах на крысах с искусственно вызванной дистрофией сердечной мышцы введение данного препарата в ранние сроки после трансплантации полученных из МСК кардиомиобластов значительно усиливало эффект проведенной терапии. Возможно, именно метапрогерол и его аналоги станут первыми агентами для лекарственного сопровождения трансплантаций МСК и других типов стволовых клеток.

ОТСТУПАЕТ НЕ ТОЛЬКО ТУБЕРКУЛЕЗ

Неожиданные результаты получены в совместных исследованиях Центрального научно-исследовательского института туберкулеза РАМН (Москва) и нашего Центра при системном введении аутологичных МСК больным с резистентными формами туберкулеза легких, для которых обычная лекарственная терапия практически безуспешна.

За последние 3,5 года дополнительную внутривенную трансплантацию наряду с продолжавшимся стандартным лечением получили более 30 больных и у всех отмечено улучшение общего состояния, уменьшение одышки, слабости. У 20 из них прекратилось выделение бактерий, а у 11 зафиксировано заживление каверн легочной ткани. В подгруппе, где МСК трансплантировали 1,5 - 2 года назад, у 9 из 16 пациентов в настоящее время можно констатировать стойкую ремиссию туберкулезного процесса, у 6 наблюдается положительная бактериологическая и морфологическая динамика и лишь у одного из них эффект ограничился незначительным клиническим улучшением. Есть все основания утверждать: именно трансплантация аутологичных МСК позволила достичь прогресса в борьбе с резистентными формами туберкулеза.

Разумеется, природа лечебного эффекта в этом случае остается пока мало изученной. Возможно, наличие в легочной ткани МСК тормозит в ней процессы повреждения (за счет подавляющего действия стволовых клеток на выработку активных форм кислорода эффекторными клетками кроветворной и иммунной систем). Вероятно, трансплантат, попавший в костный мозг, нормализует кроветворение, страдающее при туберкулезе, и таким непрямым методом переключает процессы тканевого разрушения на регенеративные. Надеемся, дальнейшее изучение будет способствовать развитию новых методов терапии при туберкулезе легких.

Далее. Так называемая кондиционная среда, получаемая при выращивании культуры МСК, была затем использована при лечении 84 пациентов, ранее подвергавшихся лучевой терапии по поводу злокачественных новообразований органов малого таза. Улучшение их общего состояния и резкое ослабление болей наблюдали уже на 2 - 3 сутки после начала процедур с применением указанных сред (наши сотрудники получили патент РФ на лечебное применение кондиционных сред при поражениях нормальных тканей). Исследования в данном направлении позволят разработать и другие надежные методы использования МСК и продуктов их жизнедеятельности при лечении больных в онкорадиологических клиниках.

ДОСТАВИТЬ ГЕН ПО АДРЕСУ

Изучение закономерностей поступления МСК в облученный организм указывает на перспективы использования этих клеток в другом качестве - агента для доставки необходимых генов в поврежденные органы и ткани. Ныне применяемые вирусные и невирусные векторы не лишены серьезных недостатков, часто малоэффективны, а в ряде случаев - опасны. МСК же пригодны для введения в них нового генетического материала, так как уже в экспериментах показана высокая эффективность их трансдукции (порядка 80 - 90% и более) при использовании различных векторов, длительная экспрессия гена в ряду поколений этих клеток и сохранение трансдуцированными клетками основных дифференцировок МСК. Требуется лишь обеспечить направленный "хоминг" генмодифицированных МСК в нужные ткани, особенно те, в которые они поступают в небольшом количестве.

О реальности решения этой задачи говорят экспериментальные данные, полученные в нашей стране и за рубежом. Как выяснилось, локальное облучение в нелетальных дозах различных участков тела животных значительно усиливает доставку МСК в пораженные ткани, в том числе и такие, куда в интактном организме их миграция незначительна (например, в кишечник при облучении живота). Это открытие дает надежду на создание метода избирательной транспортировки МСК с дополнительно включенными генами в различные ткани для проведения генотерапии. Суть ее в индуцировании процессов апоптоза (гибели клеток) или усилении чувствительности опухоли к последующей химио- и лучевой терапии. Впрочем, такая адресная доставка генов необязательно требует предварительного облучения злокачественной ткани. Так, уже установлено: МСК достаточно интенсивно могут накапливаться в строме многих опухолей.

Следует отметить, что довольно далеко продвинулись исследования по использованию клеточных культур МСК, дифференцированных в направлении остеогенеза и хондрогенеза. Эти результаты уже применяют в клинической практике при замещении костных дефектов и поражений суставного хряща. Причем отечественные ученые в ряде случаев выступили авторами пионерских разработок. Так, еще в 1988 г. Министерство здравоохранения СССР утвердило методические рекомендации по замещению костных дефектов с помощью культур, получаемых при культивировании стромальных клеток костного мозга человека. Авторы методики - сотрудники лаборатории Александра Фриденштейна и их коллеги из других институтов. Аналогичные предложения фирмы "Osiris Therapeutics Inc." (Балтимор, США) появились спустя почти 15 лет (кстати, их авторы неоднократно подчеркивали первенство советских специалистов).

В настоящее время в связи с тем, что в условиях in vitro и in vivo для МСК мышей и человека продемонстрированы возможности дифференцироваться не только в адипоциты, остеоциты и хондроциты (клетки жировой, костной и хрящевой тканей), но и в миоциты (клетки мышц), гепатоциты (клетки печени), миофибробласты, клетки легочного эпителия, почечных канальцев и ряд других типов, начаты попытки экспериментально обосновать использование МСК и их потомства при лечении самых разнообразных заболеваний. Большинство подобных исследований пока не вышли за рамки накопления материалов. Сейчас можно лишь констатировать несомненный факт: МСК стали своеобразным "золотым стандартом" клеточной терапии, на их применении в ближайшие 10 - 15 лет будут основаны главные достижения регенеративной медицины.

В 1969 г. Рэм Петров (академик с 1984 г.) и Лия Сеславина (впоследствии доктор медицинских наук), исследуя взаимодействие лимфоцитов с кроветворными стволовыми клетками, открыли, что в результате его аллогенные клетки инактивируются, а сингенные изменяют направление своей дифференцировки. Иными словами, был найден путь и выяснена возможность направлять развитие стволовых клеток (взрослых).

Эндотелий - однослойный пласт плоских клеток, выстилающий внутреннюю поверхность кровеносных и лимфатических сосудов, сердечных полостей.


Доктор биологических наук Анатолий КОНОПЛЯННИКОВ, доктор медицинских наук Михаил КАПЛАН, академик РАМН Анатолий ЦЫБ, Медицинский радиологический научный центр РАМН (город Обнинск Калужской области)

Авторские права на статьи принадлежат их авторам
Проект компании Kocmi LTD