Биология

Газовихревой биологический реактор

Сибирской инновационной компанией создан газовихревой биологический реактор, по своим характеристикам не имеющий зарубежных аналогов. Новые технологические принципы, на основе которых он сконструирован, позволяют выращивать в нем даже стволовые клетки. Эта разработка, по мнению специалистов, - одна из наиболее перспективных в области высоких технологий в России. Свидетельство тому - патенты, полученные в США и ряде европейских стран, медали и дипломы крупных международных выставок.

Простейшие биотехнологические приемы люди освоили еще до новой эры. Так, в древнем Шумере (современный Ирак) более 6 000 лет назад уже применяли один из них - брожение. В чанах, бурдюках, амфорах получали его продукты: пиво, вино, кумыс, тесто для пористого хлеба. Что касается специальной биотехнологической аппаратуры, то она появилась гораздо позже. Первой в этом ряду стала чашка Петри. Ее в 80-х годах XIX в. для Роберта Коха* разработал его сотрудник Юлиус Рихард Петри. Плоская стеклянная банка с крышкой до сих пор в ходу у микробиологов всего мира. Именно с ее помощью Кох в 1882 г. впервые выделил чистую культуру туберкулезной бактерии.

Очередным толчком для появления нового оборудования послужило открытие пенициллина в 1928 г. английским ученым Александром Флемингом (нобелевский лауреат 1945 г.). Антибиотик очень быстро доказал необходимость массового выпуска, но достичь этого долго не удавалось. Лишь в 1943 г. в США нашли эффективный его продуцент - гриб Penicillium chrysogenus, способный размножаться не только на поверхности культуральной среды, но и внутри нее. Именно "охота" за пенициллином привела к созданию биореакторов (ферментеров) - аппаратов, в которых осуществляется аэробное или анаэробное выращивание биомассы различных видов: клеток животных, насекомых, растений, микроорганизмов, грибов. Процесс этот нуждается в соблюдении многих условий. Помимо поддержания температурного и иных режимов, для эффективного функционирования реактора требуется постоянное перемешивание находящейся в нем культуральной жидкости.

Пожалуй, трудно назвать отрасль, в которой процесс перемешивания не присутствует. Но есть такие, где он составляет основу производства. Это биотехнология, химический синтез, пищевая промышленность. Общеизвестны и применяются два способа. Первый - использование погруженного в жидкость механического устройства (простейший пример такой "мешалки" - ложка в стакане чая). Второй - перемешивание за счет продувки газа через жидкость в эрлифтных аппаратах. В реакторах с механической мешалкой более 70% потребляемой мощности расходуется на преодоление сил сопротивления среды, при этом происходит избыточно-вредный нагрев жидкости. Лишнее тепло необходимо отводить, что требует дополнительных затрат.

Есть недостатки и у эрлифтных биореакторов: из-за слабого перемешивания они не пригодны для вязких сред; всплывающие воздушные пузырьки "схлопываются" при контакте с находящимися в жидкости живыми клетками и наносят им травмирующий кавитационный удар. Обильное пенообразование не дает использовать весь объем аппарата, а применение химического пеногасителя снижает качество конечного продукта.

Впрочем, большинство используемых в мире реакторов - комбинация этих типов аппаратов, но и подобный симбиоз не избавляет от органических дефектов, связанных с недостаточностью поверхностного массообмена, наличием турбулентных и застойных зон, высоким энергопотреблением, низкими характеристиками при работе с вязкими средами.

Биотехнологическое производство строится так, что биомасса наращивается постепенно - от малых объемов на начальном этапе к большим в конце. Биокультуры могут интенсивно развиваться в ферментере, только имея определенную начальную концентрацию. Для "старта" количество клеток в посевной дозе должно быть порядка 300 тыс. на 1 мл, после чего можно ожидать увеличения их численности в аппарате в 4 - 6 раз. Затем рост прекращается, ибо выделяемые клетками метаболиты не дают им размножаться дальше. И биомасса, разведенная до начальной концентрации, может послужить посевной дозой для 4 - 6 аналогичных по объему биореакторов, либо для установки в 4 - 6 раз большего объема. Легко посчитать, сколько и каких ферментеров потребуется для запуска аппарата с рабочим объемом 1 м. Цепочка получается такая: 1,6 > 8 > 40 > 200 > 1000 л.

Возникает вопрос: нельзя ли вместо пяти аппаратов иметь всего два (скажем, 40 и 1000 л), но на начальных этапах культивирования заполнять их частично, доливая в них культуральную жидкость по мере роста числа клеток? К сожалению, в аппаратах традиционных типов это невозможно. Ферментеры с мешалкой, как правило, функционируют в оптимальном режиме лишь при строго заданном уровне жидкости. Его колебание приводит к изменению гидродинамики и, соответственно, условий культивирования, а значит, к нежелательным последствиям.

Существующие типы реакторов в целом устраивали исследователей, пока они не начали экспериментировать с легко травмируемыми клетками (в том числе, с эмбриональными и гибридомами*), не заинтересовались проблемами внеклеточного белкового синтеза, культивированием клеток насекомых. Для этих объектов стандартные аппараты оказались мало пригодны.

Некий выход из положения нашли. Появились реакторы с крутящимися корпусами, с парусными мешалками из мягких синтетических материалов, даже с магнитными частицами в суспензии, приводимыми в движение вращающимся магнитным полем. Но эти ухищрения хороши в лабораторных экспериментах, а не в крупномасштабном производстве. Разумеется, новые конструкции биореакторов разрабатывают постоянно: с 1976 по 1996 г. в мире было выдано более трехсот патентов на различные ферментеры. Однако в технических решениях использовали старые, не выходившие за привычные рамки, способы перемешивания. Хотя, как оказалось, возможен и принципиально новый вариант реализации этого процесса.

В конце 80-х годов XX в. сотрудник Института теплофизики им. С. С. Кутателадзе СО РАН, доктор технических наук Василий Кислых, занимавшийся исследованием вихревых процессов, перейдя на работу в созданный в поселке Кольцове под Новосибирском Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (ныне Научно-производственное объединение "Вектор"), выдвинул идею создать аппарат, использующий для перемешивания культуральной среды организованный и управляемый воздушный вихрь. Здесь предложение оценили, поскольку в случае удачи появлялась возможность получить реактор, в котором культивировались бы легко травмируемые клетки. Удалось построить несколько экспериментальных образцов, но работы были остановлены из-за отсутствия финансирования. Сама же идея оказалась настолько перспективной, что группа инженеров и конструкторов, в которую вошел и Кислых, на свой страх и риск попыталась довести ее до воплощения. Результатом стало появление абсолютно нового типа аппаратов - газовихревых безградиентных реакторов.

Принципиально важно, что в этих аппаратах перемешивающее устройство не погружено в жидкость, а значит, отсутствуют вызываемые этим фактором негативные последствия. Реактор представляет собой термостатированную емкость с установленным над поверхностью культуральной среды центробежным активатором, который, вращаясь, формирует интенсивный вихрь воздуха. С помощью специальной плавающей шайбы вихрь проецируется в жидкость. Перемешивание обеспечивается за счет разницы давления над ее поверхностью и силы трения об нее воздушного потока.

В жидкости создается трехмерное движение типа "вращающегося вихревого кольца" (квазистационарный поток с осевым противотоком). Этим достигается мягкое, весьма эффективное перемешивание без образования пены, гидроударов, кавитации, высокотурбулентных и застойных зон. В газовихревом реакторе 98% мощности используется непосредственно на перемешивание, вводимая энергия распределяется по всему объему равномерно, поэтому не образуется микрозон локального перегрева. Прямые энергозатраты сокращаются в 7 - 10 раз по сравнению с другими установками аналогичного назначения. Аппарат справляется даже с особо вязкими жидкостями. В наших совместных работах с Институтом нефти и газа им. Губкина (Москва) в ферментере получены полисахариды с вязкостью в 1270 раз выше, чем у воды. Газовый вихрь - эффективный пеногаситель. Гидродинамика реактора мало зависит от уровня жидкости в нем.

В зависимости от технологических требований заполнение аппарата изменяется от 10 до 90% его физического объема, следовательно, можно сократить число установок промежуточных размеров. На практике это означает, что для запуска в работу 1000-литрового ферментера с газовихревым перемешиванием нужен всего один 20-литровый биореактор того же типа.

Серьезная проблема при внедрении многих лабораторных разработок в производство - сложность воспроизведения процесса при увеличении объемов культивирования. Особенно это ощущается при работе с чувствительными клетками (гибридными, эмбриональными и т. п.), что связано с гидродинамикой процесса перемешивания в существующих биореакторах - она значительно меняется в зависимости от объема аппарата. При газовихревом способе перемешивания таких проблем нет. Практически идеальные условия культивирования клеток приводят к сокращению времени технологического процесса.

При изучении возможностей нового биореактора в различных научно-исследовательских институтах проводили эксперименты по выращиванию эмбриональных клеток, гибридом, клеток насекомых, растений, грибов, дрожжей, бактерий. И все прошли успешно.

Впервые в газовихревом биореакторе на базе Института цитологии и генетики СО РАН доктором биологических наук Сергеем Киселевым и кандидатом биологических наук Марией Лагарьковой были выращены эмбриоидные тельца* из культуры эмбриональных стволовых клеток человека*. По структуре упомянутые тельца похожи на двуслойный яйцевидный цилиндр 6-дневного эмбриона мыши. Это сходство в развитии биологического процесса позволяет использовать их как модельную систему для изучения ранних стадий эмбрионального развития. На сегодня они необходимы для получения специализированных клеток - нейрональных, гемопоэтических (кроветворных), инсулин-продуцирующих и ряда других - путем направленной дифференцировки, поскольку в них присутствуют стволовые клетки всех трех зародышевых листков. На основе газовихревых реакторов планируется создать программно-аппаратный комплекс для размножения/поддержания недифференцированных стволовых клеток и эмбриоидных телец. Это решит проблему получения необходимых их количеств для медицинских и научно-исследовательских целей.

Одно из перспективных направлений - применение газовихревых реакторов в пищевой отрасли. В настоящее время Россия закупает 62% потребляемого в стране сахара за рубежом, являясь самым крупным его импортером в мире, хотя продукты этого ряда можно производить из отечественного сырья (в том числе из низкосортного зерна пшеницы и ржи Сибири) путем ферментативной биоконверсии крахмала. Внедрение комплексной переработки зерновых в немалой степени сдерживается крайне низкой эффективностью используемого при гидролизе крахмала оборудования. Как показали результаты работы опытно-промышленной установки объемом 2500 л, газовихревые реакторы вполне пригодны для решения и этой проблемы.

Возможная сфера применения аппаратов нового типа весьма широка. Простота устройства и дешевизна изготовления газовихревых биореакторов объемом менее 1 л позволяют выпускать их в "одноразовом" варианте, что, в свою очередь, дает возможность в условиях обычной больницы вести наработку индивидуальных биологических форм и лекарственных препаратов, адаптированных к конкретному организму. Например, можно быстро восстанавливать микрофлору кишечника, гибнущую в результате действия антибиотиков, путем культивирования собственных микроорганизмов лечащегося человека.

В заключение отметим: поскольку в процессе работы активатор непосредственно соприкасается только с газообразной средой, газовихревые аппараты могут быть эффективны для процессов перемешивания высокоагрессивных жидких сред. Проведенные эксперименты показывают перспективность таких биореакторов в химическом синтезе.
 

Справочник терминов

Линии эмбриональных стволовых клеток человека получают из внутренней клеточной массы предимплантационных бластоцист, представляющих собой стадию развития зародыша в процессе дробления оплодотворенного яйца, невостребованных после экстракорпорального оплодотворения.

Эмбриоидные тельца представляют собой переходную стадию от недифференцированных клеток, способных дать начало множеству клеточных линий, к готовым сформировать полностью дифференцированные, например, нервной или мышечной ткани.

Гибридома - клеточный гибрид, получаемый слиянием нормальной клетки с трансформированной. Обладает способностью к синтезу специфического белка, например антитела, и к неограниченному росту. Синтезируемые гибридомами моноклональные антитела применяют во многих областях биологии и медицины.
 

Юрий РАМАЗАНОВ, генеральный директор, Андрей РЕПКОВ, главный конструктор, Иван КОСЮК, технический директор, ЗАО "Саяны", Новосибирск