Химия

ФЕРМЕНТОПОДОБНЫЕ КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

Тонкое управление химическими реакциями предполагает использование различных инструментов, позволяющих их инициировать, ускорять или, напротив, замедлять, а при необходимости полностью останавливать. Существуют эффективные природные катализаторы - ферменты, и ученые во всем мире работают над созданием их синтетических аналогов. О результатах, недавно полученных нами в этой области, и пойдет речь.

СВОЙСТВА СРЕДЫ И СКОРОСТЬ РЕАКЦИИ

Современной науке известны два метода управления химическими реакциями - снижение их потенциального барьера с помощью эффективных катализаторов и использование "нанореакторов" - сред с неоднородностями размеров в несколько нанометров, эффективно адсорбирующих взаимодействующие вещества. В последнем случае механизм действия довольно прост: помещенные в неоднородную среду реагенты адсорбируются в нанополостях, растет их локальная концентрация, пропорционально увеличивается скорость реакции.

В роли нанореакторов могут выступать структурированные полимерные сетки, мицеллярные растворы и эмульсии. Эффективность работы этих сред определяется не только их строением, но и сродством реагентов к ним. К примеру, если реакция проходит между гидрофобными веществами, то ускорить ее можно, используя либо эмульсию из двух компонентов - неполярного водонерастворимого соединения и воды, либо водный раствор мицелл. При взаимодействии поверхностно-активных веществ желаемого эффекта можно добиться, применяя среды с хорошо определенными межфазными границами: помещенные в такие системы, упомянутые реагенты начнут концентрироваться в слоях толщиной в несколько нанометров - поверхностных нанореакторах, где и будет в основном проходить процесс.

Простейший случай таких нанореакторов - совокупность внешних слоев сферических капель эмульсии, более сложный - поверхность растворимой глобулы. Последний вариант реализуется при ферментативном катализе.

Для управления биологическими процессами природа создала особые макромолекулы - белки-ферменты. У каждого из них уникальная структура, задаваемая последовательностью аминокислотных остатков в полипептидной цепи, благодаря чему каталитическая функция каждого белка "настроена" на определенную биохимическую реакцию. Однако эти вещества обладают и многими универсальными свойствами, важными для их "работы". На наш взгляд, надо выделить следующие.

Во-первых, белки реализуют свою функцию в компактном (глобулярном) состоянии, а значит, имеют хорошо сформированную поверхность между внутренним неполярным ядром и внешней полярной фазой (приведенное выше определение полярности относится и к этому случаю).

Глобулы ферментов остаются в растворе и не выпадают в осадок. Это происходит благодаря их особой организации. Известно: все аминокислоты можно поделить на две группы - гидрофобные (т.е. притягиваются друг к другу и стремятся избежать контакта с водой) и гидрофильные, которые, напротив, избегают контакта со всеми мономерными звеньями и стремятся окружить себя максимальным количеством молекул воды. В белковой глобуле макромолекулярная цепь сворачивается таким образом, что гидрофобные аминокислоты оказываются внутри и формируют ядро, а гидрофильные располагаются на его поверхности и образуют "защитную оболочку", предотвращающую взаимодействия гидрофобных звеньев белка и других макромолекул, а значит, препятствующую агрегации последних и их осаждению.

Наконец, собственно каталитический эффект ферментов (снижение потенциального барьера реакции) достигается за счет так называемого активного центра, очень часто лежащего на поверхности глобулы и состоящего из нескольких мономерных звеньев белковой цепи, определенным образом ориентированных относительно друг друга.

Таковы основные принципы организации природных катализаторов, копируя которые, можно, по нашему мнению, создать их синтетические аналоги.

ФЕРМЕНТЫ КАК ПОВЕРХНОСТНЫЕ НАНОРЕАКТОРЫ

Итак, мы исходили из того, что ферментоподобный катализатор - своего рода поверхностный нанореактор, т.е. "неоднородность", благодаря которой реагенты адсорбируются в тонком приповерхностном слое.

Чтобы убедиться в вышесказанном, прежде всего исследовали простейшую реакцию преобразования субстрата (назовем его условно А) в присутствии катализатора (В). Напомним: предметом анализа является случай, когда молекулы названных реагентов имеют сложное строение, содержат гидрофобные и гидрофильные группы атомов и являются поверхностно-активными. В роли поверхностных нанореакторов выступала эмульсия, представляющая собой сферические капли масла в воде. С формальной точки зрения мы воспользовались аналогией таких капель с глобулярными белками: и в том, и в другом случае есть гидрофобное "ядро", протяженное гидрофильное окружение, четкая межфазная граница.

Помещенные в эмульсию вещества А и В предпочтительно адсорбировались на ее каплях, их концентрация в приповерхностном слое росла, пропорционально увеличивалась и скорость реакции. Оказалось, по сравнению с однородным (водным или масляным) растворителем в таких системах реакция может протекать быстрее в несколько сотен и даже тысяч раз. Расчеты показали: насколько велик будет этот "скачок", определяется поверхностной активностью реагентов (тем, насколько сильно их сродство с поверхностью) и зависит от размера капель эмульсии. Если последние малы по размерам и, соответственно, многочисленны, реагенты распределены по большой площади и их локальная концентрация не намного выше, чем в однородном растворителе. Если капли велики и/или их количество мало, то слишком незначительная суммарная поверхность эмульсии полностью покрывается небольшой долей реагентов, тогда как основная их часть рассредоточивается в объеме раствора - в воде и внутри капель масла. Скорости реакций в такой системе и в однородном растворителе не будут сильно различаться. Максимального же эффекта можно ожидать при промежуточных значениях размеров капель эмульсии, когда на их поверхности помешаются все молекулы реагентов, не оставляя на ней свободных участков.

Для экспериментальной проверки расчетов мы исследовали модельные реакции гидролитического расщепления n-нитрофениловых эфиров различных кислот (все они являются поверхностно-активными веществами) под действием различных катализаторов (кстати, эти реакции ионного обмена растворенного вещества с водой способны происходить и спонтанно). Инициировать такие превращения могут любые вещества, содержащие имидазольные группы (запомним этот термин, т.к. выбор реагентов для описываемых в данной статье экспериментов определялся именно присутствием в них названных групп), а также некоторые ионы основного характера. В общем случае эти катализаторы растворимы в воде, и чтобы придать им свойства поверхностно-активного вещества, группы имидазола были пришиты к специальной матрице.

Реакцию гидролиза n-нитрофениловых эфиров мы проводили в эмульсиях воды и неполярных углеводородов нормального строения (тетрадекана и додекана). Оказалось, значительного роста ее скорости (в несколько раз) можно добиться, только применяя поверхностно-активные катализаторы, причем желаемый результат в этом случае обусловлен исключительно эффектами концентрирования реагентов на поверхностях дисперсных капель эмульсии.

Зависимости скорости реакции (M) от размера капель эмульсии (R) при различных значениях энергии адсорбции (?); Mo - скорость реакции в однородном растворе, d - характерный размер молекул реагентов.

Одно из отличительных свойств ферментативного катализа - выполнение закона Михаэлиса-Ментен, гласящего: если при постоянной концентрации катализатора увеличивать концентрацию субстрата, то скорость реакции вначале будет расти, а потом, достигнув максимального значения, "выйдет на плато", т.е. перестанет меняться. Вычисления показали, что в нашей системе поверхностных нанореакторов кинетика процесса во многих случаях следует данной закономерности.

Основное различие белков-ферментов и рассматриваемых нами систем капель эмульсии заключается в том, что в первых каталитические группы соединены с глобулой прочными химическими связями, а во вторых связь молекул катализатора В с поверхностью "нежесткая", и он может быть частично или полностью вытеснен с нее молекулами субстрата А при высоких концентрациях последнего.

Закон Михаэлиса-Ментен в рассматриваемых нами системах выполняется только тогда, когда поверхностная активность катализатора В намного превышает то же свойство субстрата А, более того, она настолько велика, что справедливо утверждение: В "жестко привязан" к поверхности. При этом условии и "рождается" поверхностный нанореактор, который можно считать ферментоподобным катализатором.

ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ КАТАЛИЗАТОРЫ

Несмотря на то, что с формальной точки зрения поверхностные реакторы, возникающие на основе эмульсий и растворов глобул, аналогичны, последние обладают неоспоримым преимуществом: только к макромолекуле можно "жестко" пришить каталитические группы, тогда как в эмульсиях всегда велик риск, что вещество, влияющее на скорость реакции, будет вытеснено с поверхности. Кроме того, в макромолекулярных системах можно точнее задать размеры поверхностного нанореактора (в рамках описанной выше модели - "радиус капли"), их легко изменить, варьируя "качество" растворителя - температуру, состав, кислотность и т.д.

В "плохом растворителе" мономерные звенья, сильно притягиваясь друг к другу, собираются на минимально возможном расстоянии, и макромолекула формирует глобулу, или коллапсирует. В "хорошем" они отталкиваются, и макромолекула "растет", она пребывает в состоянии "клубка". Ее размеры в процессе перехода "клубок - глобула" увеличиваются в несколько раз. И если сравнивать макромолекулу с низкомолекулярным веществом, то можно сказать: "клубок" подобен газу, а глобула - жидкости.

Преимущества использования искусственных глобулярных систем в качестве поверхностных нанореакторов очевидны. Но нам было необходимо преодолеть принципиальную сложность - придать им способность растворяться в воде. Специалистам известно: как только качество растворителя становится настолько "плохим", что синтетическая макромолекула формирует глобулу, становится энергетически выгодным ее агрегирование с другими такими же структурами и выпадение в осадок. Для предотвращения этого процесса необходимо создать на поверхности глобулы гидрофильную оболочку, подобно той, которая формируется в природных белковых образованиях.

Амфифильные мономерные звенья, состоящие из групп, различающихся своим сродством с водой, представлены в виде двух соединенных бусинок: А - амфифильное мономерное звено, В - полимерная цепь из амфифильных звеньев, С - белковоподобная глобула амфифильного полимера.

Проведенный анализ показал: для решения задачи необходимо включить в цепь макромолекулы гидрофильные звенья, а для того, чтобы оболочка была плотной и действительно защищала гидрофобное ядро, они должны быть по сути амфифильными, т.е. включать и гидрофобные группы. Кроме того, все звенья вдоль цепи должны распределяться не случайно, а в соответствии с особой, так называемой белковоподобной статистикой.

Мы установили, что белковоподобные макромолекулы (формирующие растворимые глобулы) можно приготовить либо путем модификации полимера, либо синтезировать посредством совместной полимеризации или поликонденсации мономерных звеньев с существенно различными гидрофобно/гидрофильными свойствами.

Выбрав второй путь, мы получили белковоподобные полимерные цепи на основе сополимеров термочувствительного N-винилкапролактама и N-винилимидазола, ускоряющего (инициирующего) реакцию гидролиза (благодаря присутствию в его составе имидазольных групп). Цепочку организовали таким образом, что при сворачивании ее в глобулу ядро формировали звенья первого вещества, а на поверхности оказались исключительно группы второго. Вновь полученные структуры протестировали в качестве катализаторов реакции гидролиза п-нитрофенилпропионата (поверхностно-активного вещества, эфира пропионовой кислоты). И оказалось, что они малоэффективны в этой роли, если имеют форму клубка, "газообразного", разреженного и не имеющего фиксированной структуры, столь важной для процессов концентрирования поверхностной границы.

В то же время установлено: скорость реакции гидролиза упомянутого вещества в присутствии белковоподобных глобул увеличивается в 12 раз по сравнению с раствором, содержащим имидазольные каталитические группы данной концентрации, не "пришитые" к полимерной глобуле.

В случаях, когда статистика распределения групп, обладающих разным сродством к воде, случайна, "гидрофильная оболочка" на поверхности глобулы неплотная, как у аналогичных белковоподобных образований. И несколько глобул могут объединяться в растворимые агрегаты оптимального размера, в которых гидрофобные ядра нескольких цепей плотно покрываются оболочкой из гидрофильных звеньев. К примеру, сополимер винилкапролактама и имидазола со случайным распределением звеньев при высоких температурах коллапсирует, объединяясь с себе подобными макромолекулами так, что внутреннюю часть агрегата формируют звенья винилкапролактама, а внешнюю - гидрофильные группы имидазола. Такие комплексы в силу доступности экспонированных в растворитель имидазольных групп должны быть весьма эффективны как катализаторы для реакций гидролиза.

Чтобы проверить предположение, мы измерили зависимости Аррениуса для модельной реакции гидролиза n-нитрофенилацетата, протекавшей в присутствии четырех разных сополимерных катализаторов, и катализаторов другого строения, но с такими же концентрациями имидазольных групп - низкомолекулярного (метилимидазола) и гомополимерного (полиN-винилимидазола). В двух последних случаях эти зависимости линейные, что указывает на четкое следование закону Аррениуса. В первых четырех, наоборот, наблюдается резко выраженное ускорение в интервале температур от 35 до 45°С, которое в данном случае обусловлено переходом макромолекул сополимера в более компактное состояние и формированием агрегатов с четкой межфазной границей, содержащих в приповерхностном слое каталитические группы.

Отметим: поскольку термочувствительные "полимерные" катализаторы легко управляемы - с их помощью можно осуществить "запуск" и "остановку" реакции с точностью до нескольких градусов, они могут быть востребованы в особых случаях (скажем, при проведении в агрессивных средах реакций, сопровождающихся сильно выраженным эндотермическим эффектом).

В настоящее время последним необходимым условием получения ферментоподобных катализаторов остается создание аналога активного центра природного белка-фермента. Для этого надо правильно подобрать и разместить на поверхности глобулы группировки, желательное действие которых (инициирование, ускорение и т. п.) по отношению к той или иной реакции возможно только при их определенном взаимном положении и/или ориентации.

Мы ведем исследования в этом направлении, аккуратно встраивая гидроксильные, карбоксильные и имидазольные звенья в цепь термочувствительного полимера с целью создания синтетических аналогов так называемых сериновых гидролаз - ферментов, отвечающих за гидролиз сложных эфирных связей. Их активный центр как раз и содержит вышеупомянутую "каталитическую триаду" - гидроксильную, карбоксильную и имидазольную атомные группировки, ориентированные особым образом относительно друг друга.

В данной статье нами описаны основные подходы, модели и результаты работы по созданию синтетических аналогов природных белковых ферментов. Первые наши публикации на эту тему в журналах вышли сравнительно недавно - в 2004 г. Все исследования, о которых здесь говорилось, проводятся в Институте элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН коллективом ученых, в числе которых доктора химических наук Юрий Белоконь, Валерий Гринберг, Владимир Лозинский, авторы этой статьи, а также ряд молодых исследователей.


Академик Алексей ХОХЛОВ, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, доктор физико-математических наук Валентина ВАСИЛЕВСКАЯ, Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН

Авторские права на статьи принадлежат их авторам
Проект компании Kocmi LTD