Биология

ФАГОТЕРАПИЯ: МИФЫ И РЕАЛЬНОСТЬ

В настоящее время из-за бесконтрольного использования лекарственных препаратов, загрязнения природы токсичными отходами, по другим причинам произошел очередной виток эволюции бактерий - возникли их множественно-устойчивые штаммы.

Многие дорогостоящие антибиотики последнего поколения (ванкомицин, имипенем и др.) часто бессильны в борьбе с вызываемыми этими штаммами болезнями. Выход специалисты видят в развитии альтернативных медицинских методов. Наиболее перспективным считается фаготерапия - использование специфических вирусов бактерий (бактериофагов, или фагов).

О ПРИРОДЕ БАКТЕРИОФАГОВ

Заражая в очаге инфекции бактерии, фаги уничтожают их. Этот принцип лежит в основе фаготерапии, идею которой в 1917 г. выдвинул один из первооткрывателей бактериофагов канадский ученый Ф. Д'Эрелль (1873-1949). Однако появление в 1929 г. пенициллинов, ознаменовавшее начало эры антибиотиков в медицине, отодвинуло фаготерапию на второй план.

Тем не менее работу с бактериофагами продолжали. Благодаря выбору (и очень удачному!) в качестве модели для исследования основных биологических процессов группы фагов кишечной палочки был осуществлен переход от классической биологии к молекулярной, возникли генная инженерия, генотерапия, сравнительная геномика и т.д. С изучением фагов связаны такие важнейшие научные прорывы XX в., как выяснение роли нуклеиновых кислот в передаче наследственных признаков, раскрытие природы генетического кода, способов перевода его информации в белковые продукты, выяснение механизмов мутагенеза и т.д. Была исследована природа фагов, получены сведения, которых так не хватало на первых этапах их изучения. Например, установили: это живые организмы, чье развитие (как и любого другого вируса) практически полностью зависит от клетки-хозяина. Оказалось также, что существует множество фагов, способных к разнообразным наследуемым изменениям, приспособляющим их к развитию в родственных, но несхожих бактериях.

Бактериофаги - их можно классифицировать в виды, роды, семейства - обладают разной морфологией частиц. Однако несмотря на внешние отличия, у каждого из них внутри оболочки (состоящей в основном из белков) находится геном, определяющий программу их развития в соответствии с универсальными для всего живого принципами. С этой точки зрения фаговую частицу можно рассматривать как устройство для временного хранения генома и последующего введения в бактерию.

Вне клетки она биохимически инертна, а живой бактериофаг - это зараженная фагом бактерия, в которой реализуется программа развития, записанная в его геноме. Упрощенно этот процесс можно представить так: после заражения бактерии фагом начинается транскрипция (чтение генома) ферментом РНК-полимеразой. Это сопровождается образованием промежуточных носителей информации - коротких молекул информационной (матричной) РНК (и-РНК). Последние поступают в рибосомы ("белковые фабрики"), где и выстраиваются в последовательность аминокислот в белке. Следующие этапы - образование структурных компонентов фага (головок и хвостов), наполнение нуклеиновой кислотой и окончательная сборка фаговых частиц. Последовательное действие двух белков, разрушающих сначала внутреннюю цитоплазматическую мембрану, а затем наружный прочный слой клеточной стенки, обеспечивает ее разрыв и освобождение частиц потомства фага, готовых заражать новые бактерии. Таков цикл развития фагов, наиболее востребованных для фаготерапии (их называют истинно вирулентными).

Два других типа - умеренные и фаги с непрерывным циклом развития - отличаются по характеру инфекции. Первые могут выбирать между двумя способами развития - литическим (сходным с развитием истинно вирулентных фагов) и умеренным. В последнем случае фаг подавляет свой геном, синтезируя особый белок - репрессор. Он соединяется с операторным участком в геноме фага, что физически препятствует присоединению РНК-полимеразы к промотерам - участкам начала транскрипции, расположенным по соседству с операторными участками.

Неактивный геном фага называют профаг, а несущую его бактерию - лизоген. Такая клетка устойчива к действию собственного фага, иногда и других фагов. Но стоит концентрации репрессора в лизогене упасть ниже критической величины, как немедленно начинается транскрипция генома фага и его литическое развитие.

Осуществляя трансдукцию (захват в одной бактерии и перенос в другую клетку участка бактериальной хромосомы), фаги могут доставлять "патогенные островки" из бактериального генома одного хозяина в клетки других бактерий и превращать безобидные до этого момента бактерии обычной микрофлоры в патогены (это называется фаговой конверсией). К болезням, обусловленным фаговой конверсией, относятся дифтерия, скарлатина, коклюш, некоторые формы дизентерии, холеры, возможно - менингита. Поэтому умеренные фаги не используются в лечебных целях даже в виде вирулентных мутантов - из-за вероятности обратных мутаций к умеренности.

Фаги с непрерывным циклом развития (например, нитевидный mp13) постоянно синтезируются в клетке: однажды заразив бактерию, они непрестанно воспроизводятся в ней и, одеваясь в белковую оболочку, выделяются через специфическую пору Сама бактерия при этом продолжает жить и размножаться.

КОГДА АНТИБИОТИКИ БЕССИЛЬНЫ

Фаги, будучи внутриклеточными паразитами бактерий, зависят от клеток-хозяев. Скажем, практически каждая стадия развития первых требует участия бактериальных ферментов, специальных структур и т.д. Поэтому бактериальные мутации могут довольно легко блокировать развитие фага, что делает клетку-хозяина наследственно устойчивой к конкретному фагу. Чтобы избежать или хотя бы существенно снизить вероятность этого, специалисты составляют и используют смеси фагов, "живущих" в бактериях разных штаммов одного вида (или разных видов). В таком случае мутанты, проявляющие устойчивость к одному фагу инфицируются и погибают от других. Тем самым существенно понижается доля выживающих фагоустойчивых бактерий и продлевается время использования такой терапевтической смеси в лечении конкретного больного.

Эффективность такого метода лечения можно оценить с помощью общего количества видов фагов, активных на бактериях данного вида и их биоразнообразия. Например, проведенная нами экспресс-классификация группы образцов вирулентных фагов синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa показала: значительная их часть представлена единственным фагом. Отсюда следует: еще много видов, активных на этих бактериях, пока не обнаружено. С другой стороны, отдельные фаги одного и того же вида встречаются многократно. Значит, еще не выявлены те виды, которые могут оказаться как раз недостающими для фаготерапии, тогда как внесение в смесь пусть и слегка отличных, но близкородственных фагов может оказаться совершенно бессмысленным.

Выходит, поиск новых видов фагов становится приоритетной задачей специалистов. Когда же таковые с оптимальными для терапии свойствами выберут, необходимо будет установить естественные границы изменчивости разных их признаков, что позволит создавать оптимальные лечебные смеси. Кстати, чтобы поддержать высокую эффективность препаратов из комбинированных фагов, часто приходится заменять одни фаги другими. Вот почему под одной и той же этикеткой в аптеках могут предлагать препараты, содержащие наборы совершенно разных бактериофагов. Это зависит от того, какие исходные штаммы бактерий использовали для отбора наиболее активных фагов (как правило, первые берут в ближайших к предприятию-производителю клиниках).

Как мы установили, иногда возникают такие парадоксальные случаи, когда препарат, согласно прилагаемому описанию содержащий не менее 10 разных специфических фагов против кишечной палочки и подтверждающий должную активность в одном регионе, совершенно бесполезен в другом. Тем не менее, использование смесей живых фагов в терапии имеет неоспоримые преимущества благодаря оперативности, относительной дешевизне и простоте изготовления. При правильном и индивидуальном для каждого пациента подборе смесей фагов, получении их составляющих в высокоочищенном и концентрированном состоянии эффективность фаготерапии, например гнойных инфекций, достигает более 90% (по данным отечественных и польских авторов). Кроме того, использование живых фагов позволяет вводить их в организм в минимальном количестве - они будут размножаться, пока есть чувствительные к ним бактерии.

К недостаткам данного метода относятся: очень высокая специфичность смесей, требующая постоянного мониторинга и поиска новых специфических фагов; быстрое возникновение устойчивых мутантов; работа с неизученным материалом, фагами, которые содержат гены, контролирующие синтез вредных для человека продуктов.

Таким образом, терапия фаговыми смесями требует создания огромной коллекции классифицированных фагов разных видов и кропотливого подбора индивидуальной смеси для каждого пациента, постоянного мониторинга и своевременной замены фагов при утрате ими эффективности. Однако эта логически обоснованная и проверенная годами схема вступает в противоречие с подходом, который планируют использовать в Северной Америке. Согласно принципам FDA (Food and Dmg Administration) - правительственного органа США, контролирующего введение в практику лекарств, неопределенность состава медицинского препарата недопустима. Поэтому там, по замыслу, будет преобладать применение единичных природных фагов, обладающих широким спектром бактерий-хозяев или единичных для каждого вида патогенов генноинженерных фагов, иных конструкций. Основные идеи этого подхода: существенно расширить спектр хозяев вполне определенного, хорошо изученного фага модификацией аппарата его адсорбции и увеличить "убойную силу" того же фага внедрением в его геном дополнительных генов, проявляющих разный механизм уничтожения бактериальных клеток. Предполагается, что это не просто ограничит число используемых фагов, но и избавит от необходимости их замены.

Идеи создания генноинженерных фагов основаны на принципах модульной теории эволюции. Общие ее положения принадлежат двум ученым из Стенфордского университета США - А. Кемпбеллу и Д. Ботстейну. Суть же заключается в том, что многие гены, их блоки или даже участки генов представляют собой модули (подвижные и в определенном смысле независимые участки генома). Последние, если их перенести в иное генетическое окружение, будут и там осуществлять присущую им функцию (синтез определенного участка белка, структурных или ферментативно активных белков).

ГЕННОИНЖЕНЕРНЫЕ ПОДХОДЫ

В работах по генной инженерии в области фаготерапии намечается несколько разных подходов.

Один из них связан с созданием генноинженерных живых фагов, способных размножаться в клетке и одновременно содержащих несколько механизмов уничтожения бактерий благодаря встроенным в их геном нескольким модулям с разными убивающими генами. Но у этого метода есть несколько существенных недостатков. Во-первых, поскольку фаг - внутриклеточный паразит, практически на всех этапах своего развития зависящий от основных биохимических систем бактерии, в его геном можно вводить только гены, не нарушающие работу этих систем, - иначе остановится развитие и самого фага. Во-вторых, даже введение в геном фага нескольких механизмов уничтожения бактерии не гарантирует, что со временем не появятся устойчивые к ним организмы. Адсорбционно-устойчивые мутанты, если не прибегать к каким-то особым приемам, будут отбираться довольно быстро, обесценивая генноинженерные фаги и особенно природные фаги с широким спектром хозяев. Наконец, возможность трансдукции патогенных островков из хромосомы или плазмид даже при использовании вирулентных фагов не исключается, как и при использовании живых природных фагов.

Для преодоления некоторых недостатков предлагается создавать генноинженерные системы, клетки которых станут инфицироваться не живым (размножающимся) фагом, а его фантомом, несущим плазмиду, начиненную модулями с несколькими убивающими генами. Тогда вероятность выживания устойчивой бактерии станет теоретически пренебрежимо мала. Однако такое, на первый взгляд удачное, решение достигается ценой утраты основного преимущества живого фага - способности размножаться. К чему это может привести? В организм придется одновременно вводить огромное количество таких псевдофагов, что создаст сверхнагрузки для иммунной системы. Кроме того, поскольку переносчиком плазмиды-убийцы является вполне конкретный фаг, спектр активности системы будет довольно узким. Но главное возражение против использования данного метода - возможность плазмид проникать в клетки человека, что непредсказуемым образом скажется на здоровье пациентов.

Основная задача всех генноинженерных подходов - снизить специфичность действия системы любого типа хотя бы до уровня вида бактерий, что, по логике приверженцев этого подхода, исключит необходимость индивидуального подбора фаговых смесей к определенным бактериальным штаммам. Но реально это представляется малодостижимым. Если при использовании антибиотиков возникли устойчивые к этим препаратам бактерии, то где гарантия, что не возникнут бактерии, устойчивые ко всем убивающим модулям? И поскольку для поиска новых убивающих белков необходимы будут большие коллекции классифицированных фагов разных видов бактерий, то не проще ли, основываясь на таких коллекциях, продолжать то, что уже успешно работает - терапию фаговыми смесями?

ЕДИНСТВО ПРОТИВОПОЛОЖНОСТЕЙ

Интерес к фаготерапии, как уже говорилось, в первую очередь обусловлен появлением сейчас огромного количества бактерий, устойчивых к антибиотикам. Почему вскоре после введения в практику каждого нового антибиотика появляются устойчивые к нему штаммы бактерий? Не в последнюю очередь это связано с деятельностью человека и его уверенностью в возможности изменять и использовать в своих интересах весь окружающий, в том числе и живой мир. Успехи науки укрепляют эту самоуверенность. Более того, оказалось, что изменять живой мир, особенно микромир, довольно просто. Но, к сожалению, часто это ведет к необратимым последствиям, что в силу взаимозависимости и взаимосвязанности макро- и микроорганизмов представляет реальную опасность для людей.

Биомиры - единые в своей основе - развивались, изменялись и приспосабливались друг к другу в течение многих миллионов лет. Поэтому резко разорвать связи между ними без серьезных последствий нельзя. Вдумаемся: с точки зрения каждого из нас бактериальные инфекции - досадная неприятность, которую можно и нужно ликвидировать вообще. А для патогенных бактерий взаимодействие с макроорганизмами - единственный путь эволюции, сохранения определенного генофонда, необходимого для их выживания. Более того, для поддержания эффективной эволюции макроорганизмов (и человека тоже!) необходим соответствующий прогресс бактерий. Есть основания полагать, что и в появлении вида homo sapiens болезнетворные бактерии сыграли положительную роль - уменьшая количество потенциальных врагов и стимулируя развитие иммунитета. Ну а когда вид homo sapiens сформировался, он сам спровоцировал зарождение новых видов патогенных бактерий, специфичных только для человека.

Создать совершенно стерильный мир - без бактерий и болезней - значит, сделать его неживым. Так что человечество обречено на постоянную борьбу с патогенной частью микромира, в результате которой будут возникать новые виды болезнетворных бактерий, и немалую роль в их появлении могут сыграть и природная активность фагов, и еще недостаточно апробированные методы их модификации, и использование таких модифицированных систем.

Вряд ли какими-то мерами можно было предотвратить появление множественно-устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий. Они - не просто мутанты клинических патогенов, возникшие вследствие неправильного лечения (малая доза антибиотика, использование единичного антибиотика). Хотя возможно, что именно клинические мутанты запустили механизм природной генной инженерии, завершившийся возникновением множественно-устойчивых бактерий. Эти штаммы - особые. Некоторые исследователи считают, что они возникли в природных условиях, и использование антибиотиков просто позволило им занять новую экологическую нишу - клиники, больницы, роддома. Эти штаммы несут специфические элементы - интегроны, содержащие кассеты генов, обусловливающих устойчивость не только к разным антибиотикам, но и к ионам тяжелых металлов, антисептикам, УФ-облучению и другим вредным для бактерий факторам. Часто интегроны включены в плазмиды, способные к миграции между разными видами бактерий, что и обеспечивает их быстрое распространение.

Иногда высказывается предположение, будто повальное применение фагов или иных антибактериальных препаратов вместо классических антибиотиков приведет к быстрой утрате множественно-устойчивыми бактериями плазмид с кассетами генов (клеткам станет энергетически невыгодно поддерживать ставшие ненужными плазмиды), и тогда снова можно будет вернуться к классическим антибиотикам. Это мнение поддерживается происходящим иногда после фаготерапии замещением устойчивых к антибиотикам штаммов на чувствительные варианты. Мы наблюдали такое однажды даже при применении фагов у пациента с кистозным фиброзом (муковисцидозом), где, считается, их использование пока малоперспективно. Однако, хотя теоретически такое возможно, уверенности в массовости процесса утраты плазмид пока нет. Для этого мало запретить терапию с помощью антибиотиков.

Поскольку возникновение кассет с генами устойчивости через природную генную инженерию - не просто реакция только на антибиотики, но и следствие значительных изменений во внешней среде (накопление токсических соединений, тяжелых металлов, повышение фона ультрафиолетовой радиации), то нет оснований надеяться, что данные кассетные конструкции исчезнут. Это означает - при повторном применении "старых" антибиотиков устойчивые к ним гены снова быстро распространятся. Поэтому возникновение таких множественно-устойчивых патогенных бактерий, скорее всего, говорит о необратимости данного процесса и конце эры антибиотиков как способа лечения и профилактики бактериальных инфекций.

Еще одна тема - генетическая безопасность фаготерапии. Реальный опыт ее применения в России, Польше, Грузии свидетельствует: нежелательных последствий, имеющих генетическую природу, от нее не выявлено. Тем не менее, учитывая ограниченность опыта и то, что с введением фаготерапии в массовую практику в контакт с человеком (пусть и опосредованный) будут входить миллиарды живых фаговых частиц, способных к быстрой эволюции, в том числе к захвату и переносу в его микрофлору нежелательных генов, нельзя априори исключить гипотетическую возможность прямых контактов фагов с генетическим материалом индивидуума. Это слишком серьезный вопрос, поэтому в данном направлении необходимы не только дальнейшие исследования и наблюдения, но и чрезвычайная осторожность.

НЕСКОЛЬКО СЛОВ В ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фаготерапию, очевидно, пока следует использовать лишь в тех случаях, когда терапия антибиотиками бессильна. Так, уже известно несколько примеров ее удачного применения при развившемся сепсисе. Однако, как считают клиницисты, и это следует делать только по жизненным показаниям, учитывая возможность возникновения шока и развития аллергических реакций.

Особо стоит остановиться на пероральном введении, успешно используемом при лечении кишечных инфекций. В последнее время стало почти общепризнанным, что фаги, принятые перорально (после нейтрализации кислого содержимого желудка щелочной минеральной водой), быстро проникают в кровь и в другие жидкости организма. Некоторые даже считают, что данный метод может заменить внутривенное введение фагов при заражении крови. Но подтверждающей статистики пока мало. Видимо, не все фаги могут проникать в кровь при пероральном приеме. По нашему наблюдению, этой способности лишены, например, крупные фаги, родственные фагу phiKZ и активные на Р. aeruginosa (синегнойная палочка) - возможно, именно из-за их большого размера.

Как положительное свойство фаготерапии рассматривают ее высокую избирательность. Однако в условиях реальных клиник, где распространены разные штаммы патогенных бактерий, дело обстоит весьма непросто. Часто оказывается: рана, быстро очищенная специфическими фагами, может быть инфицирована иными бактериями, обитающими в данной клинике.

Скорее всего, в России целесообразно развивать привычную фаготерапию смесями живых природных фагов, особенно расширяя их видовое разнообразие. Вполне возможно, что и для ряда европейских стран этот метод станет преобладающим, по крайней мере до тех пор, пока генноинженерные подходы не подтвердят своего очевидного превосходства (в том числе и по стоимости). Поэтому введение относительно простых организационных мероприятий в использование фаговых смесей должно, по нашему мнению, существенно повысить эффективность их применения. Прежде всего - использование в клиниках смесей, приготовленных для каждого конкретного больного (естественно, специально подготовленными специалистами и из фабричных фагов-компонентов). Такой подход, к тому же, должен и удешевить лечение фагами.

Словом, пришло время активно внедрять и совершенствовать традиционно принятые способы фаготерапии в России, чтобы не оказаться безоружными перед инфекциями, вызванными бактериями, устойчивыми к антибиотикам, и не зависеть от часто неопробованных (или проверенных только на культурах клеток или мышах), в значительной степени конъюнктурных и потенциально опасных в перспективе High-tech методов, в изобилии предлагаемых сейчас на рынке медицинских услуг.


Доктор биологических наук В.Н. КРЫЛОВ, заведующий лабораторией Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Смс рассылки сервисов для эффективной рассылки.
Авторские права на статьи принадлежат их авторам
Проект компании Kocmi LTD