Биология

АРСЕНАЛ БИОТЕХНОЛОГИИ

Научно-техническая революция быстро распространяется на биологию. Прогресс в постижении процессов жизни произошел благодаря объединению биологии с химией и физикой, обретению биологами своего рода "химического мышления". Точные науки, перейдя к изучению предмета, кардинально отличающегося от им присущего, проявили свою универсальность и способствовали возникновению биохимии и биофизики, молекулярной биологии и генетики, биоорганической химии, объединенных ныне научным направлением "физико-химическая биология".

С появлением в арсенале биологов принципиально нового метода генетической и клеточной инженерии стала стремительно развиваться биотехнология, теснейшим образом связанная с практикой. По подсчетам экономистов, к 2000 г. биотехнологическое производство в мире даст товаров на сумму, превышающую 40 млрд. долларов.

Становление биотехнологии стимулирует успехи генетической инженерии. Термин этот звучит экзотично: "ген" - единица наследственной записи, святая святых живого - в сочетании со строго техническим понятием "инженерия". Однако сущность метода отражена очень точно. Генетическая инженерия - сознательное, направленное конструирование (поэтому "инженерия") функционально активных, т. е. способных работать вне организма, генетических структур. Их называют "рекомбинантные ДНК". Ну, а проще говоря, это конструирование, воссоздание искусственных программ наследственности.

Живая клетка - своеобразный миниатюрный химический комбинат с идеально отработанной технологией. Ничего лишнего, ничего ненужного, все процессы четко отрегулированы и идут в строгом согласии с тщательно выверенной наследственной программой, содержащейся в молекулах ДНК. За выполнение "производственного плана" - синтез различных белков - отвечает "центр управления": блоки-гены, каждый из которых "ведает" выработкой определенного продукта, выполняющего свои, зависящие только от него операции в клетке. Понятно, что, вмешавшись в соответствующую генетическую программу, вводя в клетку новую информацию в форме рекомбинантных молекул ДНК, исследователь может получить организм, измененный по заранее намечаемому плану.

Возможность извлекать и пересаживать гены - фантастичное, граничащее с чудом, научное достижение. Свершить такое удалось благодаря прогрессу физико-химической биологии, в частности, успехам химии ферментов и химии нуклеиновых кислот. Инструмент для ультратонких операций дала именно биохимия. Углубление знаний о работе живой клетки открыло пути для лабораторного и даже промышленного использования содержащихся в ней биологических катализаторов - белков-ферментов. В их присутствии химические реакции идут, что называется, идеально: без подогрева, при нормальных температурах и давлении, с ускорением в миллиарды раз. Поскольку действие ферментов строго избирательно (каждый из них преобразует одни строго определенные соединения, причем лишь в одном нужном направлении), они становятся незаменимыми помощниками для уникальных манипуляций с живой тканью.

Расцвету своему генетическая инженерия обязана интересным ферментам, носящим название "рестриктазы". Они узнают в ДНК с феноменальной точностью самые различные нуклеотидные последовательности - порядок "букв кода", и атакуют, разрывают их в строго определенном месте. Арсенал рестриктаз постоянно пополняется и включает уже более 400 наименований. Это позволяет исследователю разрезать и перекраивать ДНК на заранее намеченные куски и получать отдельные гены, а потом "сшивать" их в нужной последовательности.

Еще до открытия рестриктаз был известен фермент ДНК-лигаза. В природе лигаза залечивает разрыв при повреждении молекулы ДНК, восстанавливая ее первоначальное состояние.

Лигазы, как и рестриктазы, столь же важный инструмент, без которого перестройка, "перетасовка" генов была бы невозможной. Ведь если мы хотим получить гибридную, рекомбинантную молекулу, мало ее разрезать на избранные записи. Необходимо, чтобы эти записи соединились не как попало, а составили "связный текст" - подобранную экспериментатором программу. Вот здесь и незаменима лигаза. Сначала на выделенную ДНК воздействуют соответствующими рестриктазами, а затем добавляют лигазу, и исследователь создает в пробирке, в принципе, любые комбинации. Межвидовой барьер - неодолимое препятствие в природе, главный стопор в работе селекционеров - для генной инженерии почти не существует.

Сегодня в искусстве рекомбинации уже наметились пути направленных изменений, когда в ходе эксперимента в микробную клетку вводят чуждые для нее гены, даже гены человека. При этом можно добиться таких изменений наследственной программы, что чужеродный ген навяжет свой тип обмена, и клетка начнет производить несвойственный ей продукт. Так теперь будут в промышленных масштабах получать, к примеру, человеческий инсулин. Инсулин - важнейший белок, вырабатываемый поджелудочной железой и относящийся к так называемым гормонам. Он регулирует углеводный обмен, в частности уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона вызывает у людей тяжелейшее расстройство - диабет.

Рентабельный и эффективный выход дала генетическая инженерия в сочетании с химическими методами синтеза отдельных звеньев цепи нуклеиновых кислот - нуклеотидов, развитых американским биохимиком, лауреатом Нобелевской премии Г. Кораной и другими учеными. Ныне в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР завершена работа над препаратом человеческого инсулина, производимого с помощью бактерий. Короткие, синтетические фрагменты гена сшиваются вместе лигазой. Затем созданный таким образом ген, программирующий сборку белка-инсулина, вместе с участками, обеспечивающими его активность, соединяют с рекомбинантной ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Сочетание химико- ферментативного метода с генноинженерной техникой дает возможность получить первичный продукт - проинсулин, нарабатываемый бактериями. А из проинсулина легко и недорого производить инсулин, тем более, что именно таким путем: через стадию проинсулина, как я упоминал, образуется гормон у человека. Вот один из наглядных примеров промышленного биотехнологического производства.

Впрочем, проблема еще далека от окончательного решения, хотя практические результаты впечатляющи и ощутимы.

В начале 50-х годов Д. Ледерберг в кишечной палочке, постоянном спутнике человека, обнаружил кроме основной ДНК, всегда привязанной к одной, "своей" клетке, еще маленькие автономные ДНК, которыми бактериальные клетки охотно обменивались. Выяснилось, что и у высших организмов, кроме основной, ядерной ДНК, в цитоплазме тоже существуют маленькие ДНК - плазмиды.

О плазмидах заговорили через несколько лет, причем медики. Пытаясь установить, почему столь эффективные при лечении дизентерии антибиотики не действуют на некоторых больных, обнаружили: бактерии, которыми заражены люди, обладают плазмидами, содержащими по нескольку генов, устойчивых к разным антибиотикам. Затем удалось выяснить, что вообще все гены, устойчивые к антибиотикам и так осложняющие борьбу с различными инфекциями в клиниках, всегда располагаются в плазмидах. А поскольку эти автономные ДНК свободно переходят из одной бактерии в другую, стойкость к тем или иным антибиотикам распространяется среди бактерий с той же быстротой, с какой на них воздействуют. Например, бич хирургических клиник - стафилококковая инфекция - оказалась неистребимой именно из-за плазмид. Естественно, их начали детально изучать.

И вот проклятие для медиков - способность плазмид переходить "из рук в руки" - от бактерии к бактерии - оказалась ценнейшим подарком для генетической инженерии. Если плазмиды извлечь из бактерии и ввести в них чужую ДНК, а затем вновь примешать такие гибридные плазмиды к бактериальным клеткам, то часть гибридов обязательно окажется жизнеспособной и будет успешно размножаться в бактериях.

С помощью рестриктаз и лигаз получают гибридные структуры, содержащие фрагменты ДНК из любых организмов. Затем гибридные плазмиды размножают в бактериях- хозяевах, многократно репродуцируя при этом включенный участок ДНК. Процедура называется клонированием. Именно клонирование дает уникальную возможность не только манипулировать генами, но и усиливать способность живых клеток синтезировать, нарабатывать новые для них вещества в больших количествах. Вот основной принцип генетической инженерии.

Наиболее значимыми для развития этого интересного направления советских исследователей являются, например, работы по синтезу инсулина в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина. Там же проведены основополагающие исследования по биосинтезу человеческого интерферона. Он препятствует размножению ДНК-вирусов и придает незараженным клеткам устойчивость к вирусной инфекции. Однако даже для клинических испытаний, не говоря уже о широком лечебном применении, требовалось большое количество интерферона, который можно получить только от человека. Если сказать, что из каждого литра крови можно выделить всего один микрограмм интерферона - дозу, достаточную лишь для одной инъекции, - станет ясно, сколь жизненно важны были новые источники целительного вещества. Одним из них стали в последнее время сконструированные методами генетической инженерии микроорганизмы, синтезирующие человеческий интерферон с высокой эффективностью. В смеси информационных РНК, кодирующих различные белки, всего около одной десятой процента РНК, кодирующих именно интерферон. Тем не менее гены трех видов интерферонов - лейкоцитарных, фибробластных, иммунных - удалось выделить, внедрить в плазмиды бактерий кишечной палочки и клонировать, что стало подлинной революцией и в фундаментальных, и в прикладных исследованиях. Благодаря достижениям ученых Института биоорганической химии и Всесоюзного НИИ генетики налажено производство интерферонов на созданных продуктивных штаммах бактерии кишечной палочки. Удалось "воспитать" бактерии, способные синтезировать сотни микрограммов ценнейшего вещества в расчете на литр раствора, где содержатся клетки.

Поскольку арсенал генетической инженерии постоянно расширяется, процесс получения интерферонов совершенствуется. Сейчас их гены клонированы в дрожжи и в клетки высших микроорганизмов, обладающих ядром. Вероятно, именно такой способ станет в ближайшем будущем наиболее эффективной основой промышленного производства других интерферонов человека. Мало того. Выяснение специфичных особенностей различных видов интерферонов, сопоставление их структурных и фармакологических отличий открыли путь к улучшению полезных свойств с помощью направленных изменений генов. Уже создаются гибридные гены, которые после введения в клетку-хозяина будут программировать синтез гибридных интерферонов. В Институте биоорганической химии получены гибриды под названием альфа-А, альфа-D и альфа-F со свойствами, значительно отличающимися от исходных индивидуальных веществ. Методы генетической инженерии, прогрессирующие гигантскими темпами, позволяют "вживлять" гены человека в бактериальные клетки, создавать штаммы - культуры микроорганизмов (кишечной и сенной палочки, дрожжей и др.), синтезирующие важнейшие гормоны, белки крови, ничем не отличающиеся от человеческих. Поэтому очевидно: в самом ближайшем будущем в медицине произойдет подлинный переворот. Доступность физиологически активных веществ для подробного изучения их функций и применения в лечении болезней позволит в ряде случаев исцелять больных белками человека, лекарством, точно бьющим в цель, и естественным для организма веществом, не дающим нежелательных побочных эффектов.

В качестве примера можно привести получение коллективом лаборатории функциональной энзимологии Института молекулярной биологии АН СССР соматотропина - гормона роста человека - в бактерии кишечной палочки. Как же заставили ген человека работать в микроорганизме, в полностью чуждом для него окружении, не менее эффективно, чем в его собственной стихии?

К гену человека "приклеили" регуляторные элементы кишечной палочки - все необходимое для синтеза информационной РНК, а затем и белка. Человеческий ген переделали в функционирующий, т. е. в данном случае в бактериальный ген, управляющий производством именно гормона роста, но с нужной "человеческой программой". А поскольку сейчас уже накопилось много сведений о регуляторных "записях" - последовательностях, запускающих ген в работу, - то удалось выбрать наиболее эффективную их комбинацию. После перенесения такой остроумной конструкции в клетку микроорганизма остается лишь получить культуру бактерии, способную синтезировать нужный продукт в больших количествах: до многих сотен молекул на каждую клетку

Если задача научных исследований - не просто демонстрация возможностей генетической инженерии, а реальное воспроизводство гормона - препарата для практических целей, то следующую, не менее важную стадию можно считать уже чисто биотехнологической, хотя столь же сложной. Это - оптимизация условий культивирования колоний микроорганизма, очистка продукта. У нас в стране такого рода разработки проведены учеными академических Институтов молекулярной биологии и биоорганической химии с участием исследователей институтов Министерства медицинской промышленности и Главмикробиопрома. В результате создан экспериментальный лекарственный препарат, проводятся его доклинические испытания.

Ростовой гормон, состоящий из 191 аминокислоты, как и интерферон ("альфа", к примеру, содержит 166 аминокислот), относится к сравнительно большим белкам. Часто физиологически активные вещества, такие, как гормоны и нейропептиды, имеют значительно меньшие размеры. И оказалось: кишечную палочку трудно заставить производить в значительных количествах короткие пептиды из 30 - 40 аминокислот или же очень большие. По всей видимости, слишком маленькие просто-напросто расщепляются в бактериальных клетках. Пришлось ученым прибегнуть к ухищрениям, опять же подсказанным природой: создать гибридные белки, у которых одна из частей взята от какого- нибудь распространенного и хорошо синтезирующегося в микробной клетке белка, а уже к ней, через аминокислоту- связку присоединить нужный пептид.

В Институте молекулярной биологии осуществлен синтез гена другого важного гормона человека - кальцитонина - гормона щитовидной железы. Ген синтезируют, "составляют" химики по частям, небольшими фрагментами, затем собирают и "склеивают" лигазами.

Каждый день приносит нам вести о выделении все новых генов, ответственных за производство белков человека и животных. Это и ферменты, растворяющие тромбы, и новые гормоны, и вещества, регулирующие обмен гормонов.

Далее надо в первую очередь упомянуть перестройку наследственной программы растений, в частности новые методы гибридизации. В этом случае используют в качестве исходных не половые клетки (гаметы), а клетки тела - сомы растений. Их обрабатывают специальными ферментами, чтобы удалить жесткие оболочки, а "голые" клетки - изолированные протопласты - заставляют сливаться друг с другом. Из гибридных клеток, полученных таким способом, можно вырастить клеточную массу меняя условия культивирования, сообщить клеткам способность к организованному росту и в конечном счете заново получить целые гибридные растения. Это не только новый инструмент генетического анализа, но и важное дополнение в арсенале приемов практической селекции сельскохозяйственных растений. Исследования являются частью целевой комплексной программы "Биотехнология". На опытных плантациях Института ботаники АН Украинской ССР и Института физиологии растений АН СССР подобные гибриды картофеля, табака уже перестали быть объектом лишь лабораторного изучения. Первые экземпляры таких растений отправлены на опытные поля.

Не менее перспективны работы, связанные с введением в клетки растений искусственных генов, т. е. навязывания им новой информации. Достигнутый уровень техники позволяет "вживить" чужеродный ген в одну-единственную клетку и вырастить из нее растение, наделенное заданными свойствами. Уже получено в нашей стране растение с искусственно встроенным геном микроорганизма, придающим ему устойчивость к антибиотикам.

Разработаны системы клонирования ряда важнейших сельскохозяйственных культур по схеме: протопласт - клеточная культура - целое растение. Отлаживается система введения чужеродного генетического материала в протопласты с помощью липосом. Изучают ДНК плазмид бактерий, вирусов и собственные внехромосомные ДНК растений для использования в качестве векторов - "внедрителей" наследственной информации, что поможет создавать виды и сорта высокоурожайные, стойкие к заболеваниям и неприхотливые к составу почвы и влажности, или сами себя удобряющие. Например, современное сельское хозяйство немыслимо без достаточного обеспечения растений азотом. На производство азотных удобрений человечество тратит более 1,5 % наличной энергии и невосполнимые запасы полезных ископаемых, таких, как нефть. Используются же эти удобрения в лучшем случае на 50 %. Другими словами, из 50 млн. т. мирового производства азотных удобрений 25 фактически разлагаются в почве, образуя ядовитые окислы, отравляя природу. При биологической же фиксации азота источником энергии служит Солнце, и фиксированный бактериями азот усваивается полностью. Беда в том, что человек не умеет активно управлять этим процессом. Поставщики биологического азота на культивируемых землях - клубеньковые бактерии (ризобии), сине-зеленые водоросли. Перед исследователями стоит задача: постичь генетику клубеньковых бактерий и молекулярно-генетические основы азот-фиксации.

Разумеется, было бы ошибочным полагать, что генетическая инженерия и новая биотехнология станут панацеей от всех бед и полностью заменят традиционные методы. Однако новые молекулярно-биологические подходы могут применяться, как мы видим, с огромной пользой для улучшения белкового состава, защиты от болезней, предотвращения загрязнений окружающей среды. Это то, что очевидно сегодня. Зачастую трудно предсказать, к каким неожиданным и важным для практики результатам могут привести фундаментальные научные исследования.

Конечно, умение управлять генами накладывает дополнительную ответственность и содержит определенную степень риска. Но лучше мы будем в состоянии управлять генами, чем продолжать мириться с тем, что они управляют нами. Комитет по генетическому экспериментированию при Международном совете научных союзов постоянно занимается оценкой предполагаемых опасностей научных разработок с учетом перспектив генетической инженерии, практических приложений - для унификации правил и норм безопасности. Многие страны выработали свои правила безопасности по генетической инженерии. В Советском Союзе все исследования по биоинженерии строго регламентированы в соответствии с международными нормами безопасности работе рекомбинантными ДНК. Сдерживающая осторожность и высокая ответственность - ценные и нужные человеческие качества, что, на мой взгляд, справедливо всегда: и для атомного века, и для грядущего века - генетического.

Академик А. А. БАЕВ, академик-секретарь Отделения биохимии, биофизики и химии физиологически активных соединений АН СССР